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生物樣品超薄切片技術
與電鏡觀察（一）
——樣品制備

一、超薄切片技術——為什么做超薄切片
超薄切片技術是生物電鏡技術中最基本、應用最多的樣品制備技術，也是一個電鏡實驗室存在與發展必備的基本技術。它不僅越來越廣泛地應用于不同的模式生物、不同個體的發育階段、不同個體的器官組織及不同生理和病理情況下的超微結構研究，而且也是不斷發展的各種新技術的基礎。它可以幫助科學家們更好地研究生物體的結構和功能。這種技術可以將生物體切成非常薄的切片，使得科學家們可以更加清晰地觀察生物體的內部結構。
在本文中，我們將探討超薄切片技術制備流程、常用固定劑的介紹以及它在生物學研究中的應用。透射電鏡觀察對樣品的要求：

1、為了使電子束穿透樣品，超薄切片的厚度通常為70nm左右，約等于紅細胞直徑的1%

2、在制樣過程中，樣品的超微結構必須得到完好的保存，應嚴格防止樣品結構和性質發生改變以及樣品遭受污染等，因此超薄切片室必須非常潔凈；3、樣品應牢 固地置于直徑為3mm的專用載網上，以便能經受電子束的轟擊，并防止在裝卸過程中的機械振動而損壞；4、樣品必須干燥且導電。
樣品類型：
①材料樣品：有機高分子材料和無機粉體材料、金屬材料和其他無機材料高分子聚合物（如聚丙烯、高密度聚乙烯、尼龍等）；工業材料如聚合物（橡膠和塑料）以及韌性、硬質或脆性材料（金屬或陶瓷）；
②生物樣品：如細胞、組織、病毒、蛋白質等。

二、生物樣品超薄切片技術——制樣流程
1、取材：生物樣品的采集亦稱取材。對取材過程的基本要求是：確保樣品盡可能接近自然生活狀態，同時確保定位準確。注意生物樣品的特殊性。
①定位準確——取材最重要的操作是定位準確，注意組織取材的極性和方向性。
②取材快捷——取材操作要快捷。樣品在離體后以最快的速率浸入初固定液，以免長時間缺血缺氧引起組織細胞自溶，并防止微生物繁殖導致樣品腐敗，破壞精細結構。
③樣品尺寸合適——對樣品尺寸的限制主要是基于對固定液穿透能力的考慮，體積一般以約1mm3的為宜。 

                                                           A.接近正方體形狀的樣品顆粒，約1mmx1mmx1mm；

                                                           B.接近長方體形狀的樣品條，約1mmx1mmx3mm；

                                                           C.薄片狀樣品，約1mmx2mmx3mm。

④操作輕柔——輕柔的操作可減少人為機械損傷，盡量避免金屬器具對組織細胞的夾持、擠壓和牽拉。另外，組織細胞一定要用緩沖液清洗。
⑤溫度合適——對于原位固定取材的組織、離體的新鮮組織或培養的細胞，緩沖液和固定液的溫度應接近生理溫度。取材后0.5 h左右可將固定的樣品置入4℃冰箱保存。
2、固定：將新鮮的活組織從生物體取下后，立即投入固定劑中，借助化學藥品的作用，使細胞保持原有形態和結構，更好地保存其超微結構。生物樣品的固定技術包括化學固定與物理固定（冷凍固定）兩大類。
固定劑的種類：
①醛類固定劑：醛類固定劑包括戊二醛、丙烯醛、甲醛、多聚甲醛等。
②四氧化鋨固定液。
③其它固定液：包括高錳酸鉀、四氧化釕、單寧酸等。

固定劑的主要作用是使蛋白質、脂質等生物大分子發生某種交聯。理想的固定劑應使細中各種成分都得到良好固定，但實際上，至今還沒有一種能夠把細胞中的物質全部固定的全能固定劑，不同固定劑對細胞成分的固定具有選擇性。

3、浸洗：醛類固定液固定后，組織中的殘留醛易與四氧化鋨反應產生細微的小顆粒沉淀，所以浸洗要徹底。浸洗液溫度應大致與固定液溫度相同。浸洗時間對不同的樣品有不同的要求，但一般樣品浸洗為2-3次，每次5-10min，并不是時間越長越好。

4、脫水：脫水是用有機溶劑逐漸將樣品中游離水完全取代的過程，其最終的有機溶劑必須能較好地與水和包埋劑混溶。
脫水的目的：
①避免樣品中的水分在鏡筒高真空下汽化引起污染并破壞真空；
②包埋用試劑大都是非水溶性的，組織內存在的游離水會影響包埋劑的浸透；
③采用能與水和包埋劑混溶的有機溶劑替代其它脫水劑。

脫水劑：所有可以脫水的有機溶劑之總稱，有乙醇、丙酮和環氧丙烷。電鏡常用的脫水劑為乙醇和丙酮。
脫水步驟：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇2次、100%丙酮2—3次（5—10 min/次）。

5、浸透：是用包埋劑逐漸取代組織中脫水劑，使細胞內外空隙被包埋劑填充。經過脫水的組織，先放入不同比例的包埋劑與脫水劑混合液中浸透，然后放入純包埋劑中浸透，浸透時間根據不同樣品和不同包埋劑確定。

6、包埋：是將浸透好的組織放在填有包埋劑的平板模具或膠囊中。然后，通過加熱聚合將極小的組織固定在凝固的包埋劑中，得到樣品包埋塊，以便進行超薄切片。通常包埋劑分為環氧樹脂類和水溶性樹脂。

7、切片：制作超薄切片，需要使用專門的超薄切片機來完成。切片厚度一般為70nm左右，約等于紅細胞直徑的1%。超薄切片室必須非常潔凈且相對封閉，進入之前要換干凈的鞋子和工作服，盡可能減少人員往來走動。

8、染色：利用某些金屬鹽類與細胞中各種成分不同程度的結合的特性，對切片樣品進行電子染色處理，增加圖像的反差。常用染色劑有乙酸雙氧鈾、鉛鹽類染色劑（如檸檬酸鉛）、高錳酸鉀、硝酸鑭、釕紅等。
影響生物組織樣品制備成功率最重要的是取材！！！
本文部分內容摘自《生命科學中的電子顯微鏡技術》高等教育出版社

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